Метод пэтч-кламп

Метод пэтч-кламп (patch-clamp) позволяет осуществлять локальную (точечную) фиксацию мембранного потенциала и измерять токи через одиночные ионные каналы. На данный момент этот метод является мощным средством для исследования биомембран. Метод позволяет:

1. проводить многие исследования в рамках классических электрофизиологических подходов.

2. регистрировать токи и потенциалы от клеток очень малых размеров (3-10 мкм)

3. регистрировать токи одиночных каналов амплитудой порядка пикоампер

4. исследовать действие лекарственных препаратов при быстром подведении их как к наружной, так и к внутренней стороне мембраны

Метод пэтч-кламп был введен в исследовательскую практику Неером и Сакманом, когда в 1976 году ими была опубликована статья в журнале “Nature”, которая называлась “Токи через одиночные каналы в мембране волокна денервированной мышцы лягушки”. Это открыло путь для изучения на молекулярном уровне электрических свойств мембран и регуляции различных транспортных процессов.

Основой для создания метода послужило обнаружение факта, что при определённых условиях клеточная мембрана формирует очень плотный контакт с поверхностью кончика стеклянного микроэлектрода. При небольшом разрежении, создаваемом внутри пипетки, между стеклом и мембранным фрагментом возникает контакт, имеющий гигаомное сопротивление. В результате образуется электрически изолированный участок мембраны, и шум регистрирующего сигнала уменьшается на несколько порядков. Так как контакт мембраны со стеклом очень прочен, то находящийся под кончиком электрода фрагмент надо либо изолировать от клетки, либо разрушить, и таким образом проникнуть внутрь клетки. Существует несколько вариантов метода пэтч-кламп (рис.2).

Наиболее близким к естественным условиям является вариант измерения ионных токов на прикреплённой, но неповрежденной (cell-attached) клетке, поскольку исследуемый участок г99зэмембраны не отделяется от клетки и не нарушается его связь с цитоплазмой. Измерение на целой клетке при разрушении мембраны в кончике микропипетки (whole-cell) позволяет заменять ионный состав цитоплазмы и изучать на диализированных таким образом клетках ионные токи в режиме фиксации напряжения.

Ионные токи через небольшие мембранные фрагменты измеряют с помощью пипеток, у которых диаметр кончика соизмерим с размерами фрагментов. Сопротивление пипеток, заполненных раствором 150 ммоль/л KCl и погруженных в раствор такой же концентрации, приблизительно линейно зависит от площади отверстия кончика и варьирует от 1 до 5 МОм. Площадь отверстия кончика пипетки можно варьировать от 1 до 8 мкм2, изменяя степень нагрева спирали на последнем этапе вытягивания. Эти размеры находятся на грани разрешения светового микроскопа. Наружную поверхность покрывают гидрофобным материалом – силгардовой резиной. Особенностью незастывшего силгарда является его способность растекаться тонкой пленкой по поверхности стекла на несколько миллиметров, покрывая при этом и кончик микроэлектрода. Так как высокоомные контакты образуются только с чистым стеклом, эту пленку необходимо удалять только оплавлением микроэлектродов. При работе на мембранных фрагментах используется несколько типов пипеток.

Пипетки из тугоплавкого стекла получили в практике большее применение, чем пипетки из мягкого стекла. Первые имеют больше удельное сопротивление, чем мягкое стекло с более низкой температурой плавления. Вследствие этого вклад шума, обусловленного ёмкостью связи через стеклянную стенку в пипетках с тугоплавким стеклом меньше.

Пипетки из толстостенного тугоплавкого стекла имеют ряд преимуществ. Во-первых, при большей толщине стенок шунтирующая проводимость через стекло меньше. Во-вторых, на некоторых препаратах гигаомные контакты более стабильны и величина их образования значительно больше, чем для аналогичных

тонкостенных пипеток

Табл.1. Геометрические параметры

кончиков пипеток, изготавливаемых

из различных типов ст. капилляров